Чудный новый miR

[MIF-zgyri]

«Наноробот цепляет инфицированную клетку крови, ныряет внутрь нее и вставляет свой молекулярный штырь в механизм, который штампует вирусы, останавливая ее работу». Утопическая история в стиле великого прожектера нанотехнологий Эрика Дрекслера? Никакой фантастики. Это всего лишь упрощенный пересказ научной работы, недавно опубликованной в одном из самых авторитетных научных журналов — Cell. Команда ученых из США, Южной Кореи и Германии почти добралась до чаши Грааля — им удалось остановить инфекцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Правда, пока только у мышей с пересаженной человеческой иммунной системой, но и это огромное достижение. Генетический аппарат, который при этом используется, 20 лет назад вообще не был известен, 10 лет считался редкой особенностью растений и червей, а сейчас за ним признают колоссальную роль в развитии всех высших организмов и ждут от него новых прорывов в медицине.


Клеточное ядро с двойными спиралями ДНК подобно корзине, наполненной генетическими инструкциями, каждую из которых нужно сначала достать, найти подходящий абзац и скопировать на молекулу РНК. Впрочем, многие участки ДНК туго свернуты и как будто обвязаны тесемками, так что прочитать их невозможно. В разных местах на гены-инструкции могут быть пришпилены скрепки — метильные группы, также делающие их нечитаемыми. Они могут сниматься и ставиться вновь, регулируя активность генов. Фото: ALAMY/PHOTAS

В конце XIX века великий Филипп Жолли уговаривал молодого Макса Планка не заниматься теоретической физикой. Она представлялась тогда в основном законченным и потому совершенно бесперспективным делом. Планк не послушался наставника и стал одним из создателей квантовой теории. За несколько десятилетий поразительных открытий от простой и стройной физической картины мира конца XIX века не осталось и следа. Век спустя сходная картина сложилась в молекулярной генетике. К началу 1990-х годов ее здание казалось в основном достроенным, оставалось лишь объяснить несколько незначительных фактов... Однако сегодня уже ясно, что эти представления были едва ли не столь же наивны, как рассуждения о генетике в терминах Ветхого Завета.

Когда гены казались простыми

Картина работы генетического аппарата представлялась в те годы довольно ясной. Генетическая информация хранится в ядре, закодированная в двойной спирали молекул ДНК. Она временно копируется на молекулы РНК, выносится ими из ядра клетки и используется для синтеза белков. Эта схема уже давно стала классической и вошла в школьные учебники. На ее основе расцвела генная инженерия — искусство целенаправленных манипуляций с генетической информацией в клетке. Казалось удивительным, что работа генетического кода устроена так остроумно и просто.

Генетический код в чем-то похож на компьютерную программу. Компьютерные инструкции записываются в цифровом виде на жестком диске компьютера, генетический код — тоже в цифровом виде на химическом носителе: двухцепочечной молекуле ДНК. С точки зрения классической генетики эта программа в неизменном виде передается из поколения в поколение. Ну или почти в неизменном — иногда случаются мутации. Процесс копирования программы во время деления клетки называется репликацией. В каждую дочернюю клетку, которая образуется в результате деления, попадает реплика, то есть точная копия каждого гена из материнской ДНК. С виду модель двойной спирали ДНК похожа на перекрученную застежку-молнию с четырьмя видами зубцов, которые стыкуются попарно. При репликации застежка-молния двойной спирали ДНК расходится, и на каждой из половинок достраивается другая лента.


Покинув ядро клетки, РНК несет генетическую депешу к огромному молекулярному комплексу — рибосоме. Здесь происходит трансляция — перевод генетического кода в структуру белковых молекул. Рибосома, двигаясь вдоль цепочки РНК (синяя), считывает код и добавляет к растущей молекуле белка (желтая) соответствующие аминокислоты. Фото: SPL/EAST NEWS

Генетическая программа должна не только копироваться, но и выполняться. В ходе ее работы создаются белки — главные молекулярные машины и строительные блоки живой клетки. Процесс происходит в два этапа. Вначале информация с ДНК транскрибируется — переписывается на другой, очень похожий носитель — молекулу РНК. От ДНК она отличается строением одного зубчика из четырех, а также основой, на которой эти зубчики сидят — она у РНК менее прочная. Причина понятна — если ДНК нужна для продолжительного хранения информации, то РНК — временный носитель, расходный материал, одноразовые дискеты или флэшки. Такая молекула РНК, на которую записана копия гена, называется информационной, или матричной (мРНК). Эта длинная цепочка — одна половинка «застежки-молнии» — может содержать до сотни тысяч зубчиков.

Когда переписывание информации завершено, мРНК выходит из клеточного ядра и встречается с рибосомой — образуется молекулярный конвейер по производству белка. Каждые три зубчика РНК кодируют один строительный блок белка — аминокислоту. Всего же в белках встречаются 20 видов таких строительных блоков, и они выстраиваются в цепочку строго в порядке, запрограммированном в РНК. Этот процесс называется трансляцией — в компьютерном мире этим термином обозначают перевод текста программы в исполняемый машинный код. Сходя с рибосомы, цепочка аминокислот сразу сворачивается и образует устойчивую трехмерную структуру. Именно в таком виде белки выполняют свои функции в клетке. Рибосомы могут неоднократно транслировать матричную РНК, раз за разом производя новые молекулы белка. Но мРНК неустойчива и через несколько часов разрушается. Поэтому считалось, что синтез каждого белка зависит главным образом от синтеза соответствующей мРНК в ядре клетки.

Конечно, схема эта сильно упрощена. Каждый из процессов — репликация, транскрипция и трансляция — мог включать дополнительные этапы. Например, выяснилось, что скопированная с ДНК молекула РНК по пути к рибосоме подвергается дополнительному редактированию — процессингу. При этом из РНК могут вырезаться значительные фрагменты кода, причем в некоторых случаях разные, а могут избирательно заменяться отдельные буквы генетического кода. Но все это не меняло сути представлений о прямой магистральной дороге от ДНК через РНК к белку.

Первые зерна сомнений по этому поводу взошли в 1990 году в горшках с петуниями по разные стороны океана. Неожиданно результаты получили специалисты из Амстердамского свободного университета и одновременно из не существующей сейчас американской компании DNA Plant Technology, которая в конце 1990-х попала под суд за махинации с трансгенным табаком.

Цвет неожиданности

Лепестки петунии могут иметь разный цвет в зависимости от активности ферментов, синтезирующих розовый или фиолетовый пигмент. Что будет с растениями, которым ввели дополнительные копии генов, кодирующие эти ферменты? Любой молекулярный биолог 20 лет назад ответил бы: разумеется, цвет лепестков станет более интенсивным. Однако заурядная работа по селекции дала парадоксальные результаты: цветки у трансгенных растений, которые должны были бы вырабатывать больше пигмента, частично или полностью теряли свой цвет. Это примерно как досыпать сахара в чай и почувствовать, что он от этого стал менее сладким.

Вскоре голландские генетики-цветоводы выяснили, что в бледных трансгенных петуниях транскрипция с ДНК на мРНК шла как обычно. Вот только трансляции, то есть синтеза белка с этих матричных РНК не происходило. Покинув клеточное ядро, они почему-то разрушались, не дойдя до рибосом. Очевидно, что механизм разрушения запускался в ответ на появление чужеродного генетического материала. А поскольку этот материал был похож на свой собственный, то механизм, тогда еще неизвестный в деталях, не разбирался и заодно уничтожал мРНК, транскрибированные с собственных генов.


На пути от ДНК к рибосоме записанный на молекуле РНК текст генетической инструкции подвергается редактированию: заменяются отдельные слова, вырезаются лишние абзацы — интроны. Происходит это так. Поскольку матричная РНК состоит из одной цепочки, а не из двух, как ДНК, каждый из составляющих ее кирпичиков-нуклеотидов стремится найти себе пару. Если в самой молекуле РНК есть «зеркальные» участки, они могут склеиться, образовав петлю, которая вскоре отрезается. В 2000 году было открыто, что в разных случаях могут вырезаться разные фрагменты РНК. Фото: SPL/EAST NEWS

Нетрудно было догадаться, зачем растениям был нужен такой механизм борьбы с чужим генетическим материалом. У них, в отличие от животных, нет иммунной системы с антителами, макрофагами и лимфоцитами. Поэтому внутриклеточная борьба с чужими генами стала одним из немногих доступных средств антивирусной защиты. На то, чтобы доказать это, ушло несколько лет. В 1997 году было показано, что растения, у которых в геноме обнаруживаются короткие «отрывки» вирусных генов, более устойчивы к действию этих вирусов. Ставили также и обратный эксперимент: в вирус подсаживали фрагмент растительного генетического кода, и в зараженном этим вирусом растении замедлялся синтез собственного белка.

Обрадовавшись, что в генетике, которая уже стала превращаться в прикладную науку, появилось что-то новое, микробиологи стали повсюду искать аналогичные механизмы. И нашли. В 1998 году американцы Крейг Мелло и Эндрю Файр (Craig Mello, Andrew Fire) опубликовали эпохальную статью про развитие круглого червя С.elegans. Это крошечное создание длиной около миллиметра с середины 1970-х годов исправно служит модельным организмом для исследований (оно даже может привыкать к никотину и страдать от абстиненции). Мелло и Файра интересовало, как влияет на развитие клеток посторонняя РНК. C.elegans был идеальной моделью для таких экспериментов — молекулы мРНК легко проникали в клетки из раствора, в котором просто вымачивали червячков. Вводимая извне мРНК, кодирующая один из важных белков C.elegans, слабо влияла на его синтез — слишком мала была выбранная экспериментаторами концентрация. Не действовала и зеркальная копия этой мРНК, так называемая антисмысловая РНК, в которой все буквы-основания заменены дополнительными к ним. Такая антисмысловая РНК способна соединяться со своей зеркальной парой подобно тому, как сцепляются нити ДНК. Ситуация резко изменилась, когда в той же концентрации червячкам вводили смесь смысловой и антисмысловой РНК. В растворе эти молекулы прилипали друг к другу, и образовавшаяся двухцепочечная РНК, несмотря на ничтожную концентрацию (всего несколько молекул на клетку!), почти полностью подавляла синтез соответствующего белка.

Спустя восемь лет Крейг Мелло проснулся среди ночи поправить постель своей дочери и заметил, что телефон беззвучно мигает зеленой лампой — звонок был выключен. Часы показывали 4.30. «Жена сказала, что уже снимала трубку, — вспоминал потом Мелло, — и какие-то шутники разыграли ее, будто бы я получил Нобелевскую премию. Но я все-таки ответил». Это была не шутка. Объявление шведского Каролинского института в 2006 году гласило: «Нобелевские лауреаты этого года открыли фундаментальный механизм, который контролирует поток генетической информации».


Приманка для мясорубки

Проникнув в клетку, двухцепочечная РНК попадает в жернова механизма, настроенного специально на ее обработку, о существовании которого 10 лет назад никто и не подозревал. Первым делом на вторгшуюся молекулу набрасывается шинковальная машина, аккуратно разрезающая ее на кусочки длиной в 21—23 основания. Эти кусочки получили название малой ингибирующей РНК, или siRNA. Данную аббревиатуру сегодня можно часто встретить в сообщениях о новых лекарствах для борьбы с вирусными заболеваниями и раком.

Белок, который шинкует РНК, получил название Dicer, от английского слова dice — нарезать кубиками. Открыли его целенаправленно, вычислив на компьютере структуру молекулы. Видя, что попавшая в клетку длинная двухцепочечная РНК разрушается, ученые примерно представили, как должен выглядеть фермент, приводящий к такому эффекту, затем нашли участки генома, в которых он мог быть закодирован, и в конце концов синтезировали по ним белок.


Путь от ДНК к рибосоме полон опасностей. Особые RISC-комплексы охотятся прежде всего на РНК, несущие вирусный генетический код. Свою жертву RISС-комплекс определяет по коротким фрагментам РНК — микроРНК (miR), оставшимся от прежних жертв. Но этих охотников можно нацелить и на глушение активности собственных генов клетки, если специально «подбросить» им микроРНК с соответствующими фрагментами кода. Это открывает перспективу лечения различных заболеваний, в том числе генетических. Фото: SPL/EAST NEWS

Нарезанные siRNA становятся наживкой, на которую ловятся путешествующие в клетке мРНК. С наживки снимается предохранитель — уходит одна из двух цепочек siRNA. Оставшаяся одиночная цепь заряжается в сложный белковый капкан, называемый RISC-комплексом. Матричная РНК, похожая на ту, которая разрезалась на короткие siRNA, клюет на эту приманку, оказывается в мясорубке RISC, где и разрезается на мелкие кусочки. Для синтеза белка она после этого потеряна.

Этот механизм запускается с любого этапа — например, появление в клетке уже готовых, нарезанных siRNA провоцирует сборку RISC и уничтожение матричных РНК, с участками которых совпадают siRNA. Клетки растений, как выяснилось, могут передавать siRNA друг другу по системе межклеточных каналов. Таким образом, клетки, которые ни разу не встречались с чужеродным генетическим материалом, оказываются готовы к тому, чтобы этот материал уничтожать.

Некоторое время считалось, что сложным механизмом реакции на чужую РНК обладают только растения и примитивные животные вроде C.elegans, обделенные настоящей иммунной системой. Однако вскоре шинковку Dicer и детали мясорубки RISC обнаружили у птиц, млекопитающих, животных и человека. Об актуальности этого антивирусного механизма свидетельствуют и сами вирусы, которые в ходе эволюционного противостояния «снаряда и брони» обзавелись собственными приспособлениями для борьбы с siRNA. Среди них, например, специальные белки, которые тормозят работу RISC-комплексов. Эти средства чрезвычайно распространены у растительных вирусов, но их нашли и у вирусов млекопитающих.

Открытие siRNA подарило новые надежды на лекарства от вирусных и онкологических заболеваний, а молекулярным биологам — заодно и надежды на новое финансирование. Помимо упоминавшегося препарата против ВИЧ, уже испытываются основанные на siRNA лекарства от рака поджелудочной железы и шейки матки, а также от макулярной дистрофии — одной из главных причин потери зрения в пожилом возрасте.

Бывший президент Стэнфордского университета Дональд Кеннеди, который до недавнего времени возглавлял журнал Science, считал, что перелом в генетике случился в 2007 году, когда «фокус исследований сместился с генетической последовательности к взаимной регуляции генов». Не слишком ли сильно сказано для аппарата siRNA, который, кажется, нужен только для защиты от внешнего генетического материала?


Генетический тормоз

В то самое время, когда ботаники-генетики по обе стороны океана удивлялись бледнеющим петуниям, Виктор Амброс с коллегами из Гарвардского университета изучал серьезные нарушения в развитии все тех же червячков C.elegans, вызванные мутацией в гене, обозначаемом lin-4. Для этого нужно было найти белок, за который отвечал мутантный ген. Скрупулезно проходя ДНК участок за участком, Амброс с коллегами сделали открытие, которое дало больше вопросов, чем ответов. Ген lin-4 оказался очень маленьким — всего 21 нуклеотидное основание — и вообще не кодировал никакой белок.

Намек на разгадку дала последовательность гена-коротышки. Она зеркально воспроизводила фрагмент гена, кодирующего белок LIN-14. Именно этот белок в аномально высоких концентрациях производился у мутантов с нарушениями в lin-4. Стало ясно, что правильный ген lin-4 каким-то образом блокирует избыточный синтез данного белка. Так исследователи впервые натолкнулись на доселе неизвестный механизм регуляции активности генов. Но еще несколько лет считалось, что найденный механизм — экзотика, присущая только червям.


Нематоды Caenorhabditis elegans — круглые черви длиной около миллиметра — один из широко используемых генетиками модельных организмов.

Перелом наступил только в 2000 году, когда другая команда исследователей во главе с Гэри Равканом из Массачусетского госпиталя в Бостоне нашла такой же короткий ген let-7. В отличие от lin-4 он блокировал образование не одного, а сразу пяти белков. Вскоре Равкан показал, что let-7 встречается у самых разных животных. А его близкий аналог нашелся в расшифрованном к тому времени человеческом геноме. Это уже нельзя было списать на экзотику круглых червей, поскольку эволюция сохранила их практически в неизменном состоянии у самых разных видов. Стало ясно, что открытый механизм играет важную роль для всего живого, позволяя регулировать активность генов с помощью собственных тормозящих РНК. Эти молекулы получили название микроРНК, miRNA или совсем коротко — miR.

К исследованиям малых ингибирующих РНК подключилось множество лабораторий по всему миру. Но каждая из них сообщала о своих результатах так, будто смежных областей просто не существует. Например, исследователи miRNA некоторое время упорно считали единственным назначением siRNA защиту от вирусов, которая никак не связана с развитием организма. Исследователи siRNA, в свою очередь, полагали, что miRNA — всего лишь частный случай механизма уничтожения матричных РНК. Специалисты до сих пор еще не договорились по этим вопросам, однако сегодня у miRNA и siRNA можно найти больше сходств, чем различий.

Эти два типа малых РНК очень близки по размеру (21—25 оснований). Смысл существования обоих — подавление трансляции белка с матричной РНК. И miRNA и siRNA готовятся при помощи шинковки Dicer. Но если две половинки siRNA-основания плотно держатся вместе, пока эта короткая РНК не попадет в капкан RISC, то miRNA путешествует по клетке в виде одиночных цепочек. Путь обеих малых РНК заканчивается ролью наживки в комплексе RISC. Причем в случае siRNA эта наживка обычно очень хорошо подходит к мРНК-мишени, а в случае miRNA может слегка от нее отличаться.

Раньше считалось, что взаимодействие с siRNA ведет к немедленному уничтожению матричной РНК, а взаимодействие с miRNA просто блокирует ее до тех пор, пока она не разрушится в клетке естественным путем. Сегодня все уже не так однозначно — обнаружены разрушающие и неразрушающие комплексы RISC, причем и те и другие могут взаимодействовать c обоими типами коротких ДНК.

Пожалуй, самое важное различие между siRNA и miRNA — точность совпадения их последовательности с РНК-мишенью. У siRNA оно абсолютное, и поэтому действие этой молекулы очень избирательное — как правило, она блокирует только одну последовательность матричной РНК, а значит, синтез одного белка. Напротив, miRNA не так хорошо пристает к своей мишени, но зато может связываться сразу с несколькими похожими РНК.

Есть и еще одно несходство: за открытие siRNA Мелло и Файр уже стали нобелевскими лауреатами, а обнаруживший miRNA Амброс своей премии пока так и не дождался.
Сложнее, еще сложнее

Описывать жизнь простой схемой «ДНК — РНК — белок» сейчас действительно кажется наивным. В человеческом геноме уже найдено 695 микроРНК, и скоро это число, возможно, дойдет до 1000. Между тем у человека всего около 20 000 генов, кодирующих белки. Если учесть, что каждая микроРНК влияет на работу нескольких из них, то выходит, что под контроль микроРНК попадает около трети человеческого генома. И это еще консервативные оценки. Самые смелые экстраполяции рисуют картину, в которой число микроРНК превышает число белковых генов. Все это складывается в невыразимо сложную систему регуляции, ведь малые РНК влияют не только на матричные РНК, но и друг на друга. Клетки вырабатывают их, чтобы бороться с вирусами, а вирусы противодействуют этому, внося в клетку свои антипоследовательности.

Этажи регуляции можно надстраивать друг над другом. Например, блокировать miRNA с помощью siRNA, отпуская тем самым тормоз синтеза сразу множества белков. И такие подходы уже используются в терапии. Например, блокируя miR-122, которая встречается в основном в печени, можно лечить гепатит и регулировать синтез холестерина. Опыты на животных показали, что таким способом удается снизить его уровень в крови на 40%.

Новые перспективы открываются и в деле лечения рака. Некоторые виды рака крови, например, сопровождаются повышенной выработкой ряда микроРНК. «Заблокировав» их, можно нарушить развитие раковых клеток. Другие виды рака, наоборот, сопровождаются падением уровня некоторых микроРНК, которые как раз подавляют активность онкогенов.

Одним из кандидатов на роль противоракового средства может оказаться уже ставшая «классикой жанра» микроРНК let-7. Введение ее мышам сильно замедляло развитие у них рака легких. Однако самые большие надежды связываются не с самими микроРНК, эффект от введения которых быстро проходит, а с их использованием в сочетании с другими средствами терапии. Работа одного из первооткрывателей молекулы, Френка Слака, демонстрирует, что введение let-7 делает опухоль чувствительной даже к малым дозам радиации. А другие микроРНК резко повышают эффективность химиотерапии.

Доставка курьером

Успех новых методов терапии с помощью малых РНК зависит от эффективности доставки этих молекул в нужные клетки. Это сложная задача: микроРНК хоть и называются малыми, но все же слишком велики, чтобы самостоятельно проникать в клетки человека. К тому же, циркулируя в кровотоке, эти нестойкие молекулы быстро разрушаются.

На решении транспортной проблемы сегодня сосредоточены громадные усилия ученых и фармакологических компаний. Например, группа под руководством Лифа Хуанга из Университета Северной Каролины включает РНК в самособирающиеся наночастицы из нескольких видов молекул. Один из этих видов «узнается» и активно усваивается клетками некоторых опухолей. Заодно клетка поглощает и наночастицу, которая внутри распаковывается и освобождает siRNA. В опухоли оказывается 70—80% всего введенного в организм препарата — выдающаяся точность доставки!

Другим путем пошла группа исследователей под руководством Премлаты Шанкар из Центра медицинских исследований Техасского технического университета и Сан Кхюн Ли из корейского университета Ханьян. Они сделали конструкцию из siRNA и антител, «узнающих» рецептор на поверхности Т-лимфоцитов. Лифмоцит, на поверхность которого садилось такое антитело, проглатывал его вместе с прикрепленной siRNA, и та блокировала работу генов ВИЧ, поразившего клетку. Именно эта работа и описана в футуристическом духе в начале статьи. Учитывая длительность испытаний и регистрации, новые поколения препаратов от рака и СПИДа могут появиться лет через 7—10. И это хороший повод, чтобы не жалеть о навсегда утраченной простоте генетического кода.

Кандидат химических наук Михаил Попов